游戏开场于1924年6月29日,在纽约州新帕尔兹的一个不知名的农场。纽约警察到达了农场并在卸货前包围了它。经过一场短暂的枪战后,两个男人走出房子投降。
故事转到10年后的1934年11月,在土耳其的伊斯坦布尔。游戏的主角安托瓦内特·马索是国际马车公司(Compagnie Internationale des Wagons-Lits)伊斯坦布尔办公室的一名忠实的初级职员。她从雇主、国际马车公司董事马塞尔·布克(Marcel Bouc)那里得到指示,照顾其好友赫尔克里·波洛。他要求马索确保波洛乘坐东方快车的旅途一切顺利。马索在锡尔凯吉车站开始了她的冒险之旅。在那里她结识了她所仰慕的波洛,以及其他一些人物,这些人后来都和她一起登上了东方快车。
列车离开伊斯坦布尔后不久,就被一场雪崩阻塞了通行。由于列车突然停驶,波洛从铺位上摔了下来,扭伤到了脚踝而卧床不起。不久之后,乘客雷切特被发现在他自己的包间被谋杀,而可能的谋杀嫌疑犯有12个人。调查从此开始了。马索受到波洛的鼓动以出面寻找谋杀案的真相,并通过搜集线索进行“跑腿”工作。
马索的任务包括照看列车(如帮助修理发动机的加热器),询问各个乘客关于谋杀的情况,以及检查火车和周围地区以寻找凶案线索。她还去了几个小说中波洛没有去到的地方,比如火车引擎室、行李车厢,还有被大雪封锁的车厢外一个旧棚屋。此外,一台坏的业余无线电被发现在其中一节车厢里。修好后,安托瓦内特可以联系上波洛的一个年轻朋友巴纳比·刘易斯,请他帮忙调查乘客背景。
与小说情节相类似,雷切特被揭露原名为卡塞蒂,是黛西·阿姆斯特朗绑架案中逃脱制裁的幕后主谋。而火车上的每一个乘客以及列车员都以某种方式与阿姆斯特朗一家联系在一起,也就是说每个人都有谋杀卡塞蒂的动机。此外,每个人都有其他乘客所证实的不在场证明。
当马索认为她已经解决了谋杀案时,波洛召集所有乘客并向马索提出一系列问题,不断质询后者所发现的线索。波洛接着揭示了对于雷切特之死的三种可能的真相。前两种与小说完全相同。在第一个解释中,波洛认为可能是一名暗杀者在夜间登上了火车,杀死了卡塞蒂,然后逃离了火车。这一解释有证据支持,比如一把带血的匕首,其上的指纹与火车上的任何人都不匹配。第二个解释则拼凑自一系列相关的线索,显示了列车上的所有乘客以及列车长皮埃尔·米歇尔应对当前发生的谋杀负责。